Selasa, 20 Oktober 2009

ISOLASI PROTOPLASMA

I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Secara konvensional, transfer materi genetik dari satu tanaman ke tanaman lain umumnya dilakukan melalui siklus seksual dengan penyilangan-penyilangan. Tidak seperti pada sel hewan, sel tanaman dibatasi oleh dinding sel yang terdiri dari serabut-serabut selulosa yang kuat. Antara sel yang satu dan sel yang lain terdapat perekat yang tersusun dalam matrik dari bahan-bahan yang mengandung pektin. Sel tanaman yang telah didegradasi dinding selnya disebut protoplasma.

Protoplasma dapat diisolasi baik secara mekanik maupun secara enzimatik. Isolasi secara mekanik saat ini sudah tidak dilakukan lagi karena sudah tidak efisien. Isolasi protoplasma secara enzimatik merupakan cara yang umum dilakukan. Teknik ini mula-mula dikembangkan oleh Cocking tahun 1960 dengan menggunakan enzim selular dari cendawan Myrothecium verrucaria. Enzim ini mula-mula dipergunakan untuk mendapatkan protoplasma dari akar tomat tetapi kemudian juga dapat digunakan untuk berbagai jaringan lain (Deden Sukmadjaja, 2008).

Bahan tanaman yang biasanya digunakan sebagai sumber protoplasma adalah daun muda, kalus, atau agregat sel dalam kultur suspensi sel. Jaringan mesofil pada daun merupakan jaringan yang paling mudah diisolasi karena sel-selnya tersusun secara renggang sehingga enzim-enzim mudah mencapai dinding sel. Daun muda atau pucuk dari biakan in vitro merupakan sumber yang lebih disukai karena sudah dalam keadaan steril. Kultur sel yang akan digunakan sebagai sumber protoplasma harus berasal dari kultur yang berumur muda antara 3-5 hari. Protoplasma membutuhkan tekanan osmotik yang sesuai sampai dinding selnya terbentuk kembali baik dalam proses isolasi maupun selama periode kultur (Deden Sukmadjaja, 2008).

Salah satu aplikasi penggunaan protoplasma yang paling penting adalah untuk hibridisasi somatik. Hibridisasi somatik khususnya diperlukan apabila metode pemuliaan secara konvensional sukar atau tidak dapat dilakukan seperti adanya inkompabilitas tanaman sehingga proses persilangan mengalami kegagalan. Fusi protoplasma dapat terjadi secara spontan atau dengan cara diinduksi pada kondisi khusus. Fusi protplasma dari sumber sel yang berbeda jarang terjadi secara spontan dan umumnya harus diinduksi dengan beberapa perlakuan baik secara kimiawi atau fisik. Induksi fusi secara kimiawi antara lain dengan NaNO3, pH tinggi/konsentrasi Ca++ konsentrasi tinggi dan polietilen glikol (PEG). Sedangkan induksi secara fisik adalah dengan mengalirkan listrik menggunakan alat fusi elektrik (elektrofusion). Teknik fusi protoplasma dengan menggunakan PEG dan elektrofusion merupakan cara yang paling banyak digunakan karena tingkat keberhasilannya lebih tinggi dibanding dengan teknik yang lain (Deden Sukmadjaja, 2008).

B. Tujuan
Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah :
1. Mahasiswa mampu menngetahui teknik isolasi protoplasma tanaman tebu sesuai prosedur













II METODOLOGI

A. Waktu dan Tempat
Waktu pelakanaan praktikum Isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan biakan in vitro daun anggrek pada hari/tanggal Sabtu 29 November 2008 pukul 09.00-15.00. Tempat pelaksanaan praktikum ini adalah di laboratorium kultur jaringan tanaman Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan (PPPPTK) Pertanian Cianjur.

B. Alat Dan Bahan
1. Alat
a. Laminar air flow
b. Alat diseksi
c. Botol steril
d. Lampu bunsen
f. Centrifuge
g. Haemocytometer
h. Tabung sentrifugasi uk. 15 ml steril
i. Mikroskop
j. Pipet pasteur steril
k. Millipore filter
l. Syringe
m. Nilon filter 60-80 ┬Ám
2. Bahan
a. Kertas saring steril
f. Kalus tebu dan biakan in vitro daun anggrek
g. Larutan enzim: 2% selulase + 0,1% pektiolase + 0,5% maserozim + 0,5% drisilase yang di larutkan dalam larutan CPW + 13% manitol
h. Larutan CPW + 13 manitol
i. Media kultur protoplama KpR
j. Larutan sukrosa 20-25%
C. Prosedur Kerja isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan daun anggrek
1. Menyiapkan 2 cawan petri steril uk. 60 x 10 mm di dalam laminar. Pindahkan kalus tebu dan daun anggrek ari botol kultur ke dalam cawan petri tersebut secara hati-hati.
2. Mengiris daun anggrek tipis-tipis (lebar 1-2 mm) dengan menggunakan pisau yang tajam.
3. Merendam kedua sumber protoplasma tersebut dengan larutan enzim yang telah disediakan dengan menggunakan filter millipore dan syringe. Volume enzim yang digunakan ± 5 ml untuk tiap
4. Menutup cawan petri dan beri rekatkan dengan parafilm, kemudian bungkus dengan alumunium foil. Simpan cawan berisi enzim dan sumber protoplasma tersebut diatas shaker dan atur kecepatannya 40-50 rpm. Biarkan selama 3-4 jam, amati setiap 1 jam dengan cara mengambil contoh larutan dengan mengunakan pipet pasteur dan teteskan diatas kaca objek. Kemudian amati pada mikroskop.
5. Setelah jumlah protoplasma dianggap cukup banyak, saring larutan dengan nylon filter dan masukan kedalam tabung sentrifugasi steril. Kerjakan didalam lamnar dan lakukan pemindahan larutan secara hati-hati dengan menggunakan pipet pasteur steril.
6. Setelah dipindahkan dalam tabung sentrifugasi, masukan tabung dalam alat sentrifugasi. Putar dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit.
7. Setelah sentrifugasi, protoplasma dan kotoran (’debris’) akan mengendap didasar tabung. Buang larutan enzim yang berada diatasnya dengan menggunakan pipet pasteur secara perlahan dan hati-hati.
8. Untuk mencuci protoplasma dari sisa enzim, masukan larutan CPW + 13% manitol kedalam tabung secara perlahan menggunakan pipet pasteur. Sambil memasukan larutan CPW, resuspensi protoplas + debris yang ada didasar tabung dengan pipet pasteur secara perlahan-lahan. Setelah teresuspensi, buat volumenya hingga 12 ml.
9. Menutup tabung, kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Lakukan pencucian ini sebanyak 2 kali.
10. Pada pencucian kedua, buat volumenya hingga 10 ml kemudian tambahkan diatasnya larutan sukrosa 20-25% secara perlahan. Sentrifugasi kembali dengan kecepatan agak rendah (1000 rpm) selama 5 menit.
11. Protoplasma akan terpisah berada pada lapisan atas tabung, sedangkan debris ada pada bagian dasar tabung.
12. Ambil protoplasma dengan hati-hati menggunakan pipet pasteur. Masukkan dalam tabung atau cawan petri steril uk. 40 x 10 cm. Encerkan protoplasma 5-10 kali konsentrasi dengan menambahkan medium KpR.
13. Amati densitasnya dengan cara mengambil contoh larutan protoplasma dengan pipet tetes dan teteskandiatas haemocytometer.
14. Amati dan hitung densitas protoplasma pada mikroskop.
15. Untuk mengkulturkan protoplasma, teteskan larutan protoplasma diatas media KpR padat atau cair.

III HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
1. Hasil isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dn biakan in vitro daun anggrek tersaji pada tabel 1.
Tabel 1. pengamatan kultur protoplasma tanaman tebu dan anggrek
No Jenis
tanaman Tgl
tanam pengamatan
Minggu
I Minggu
II Minggu III Minggu IV
1 Daun Anggrek Sabtu 29-11-08 Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon
2 Kalus tebu Sabtu 29-11-08 Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon
Dari tabel 1 diatas dapat dilihat bahwa dari hasil kegiatan praktikum isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan biakan in vitro daun anggrek belum menunjukkan respon yang positif karena hasil isolasi belum ada perkembangan apa-apa.

B. Pembahasan
Kegiatan isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan biakan in vitro daun anggrek masih perlu dilakukan pengamatan lebih lanjut untuk mengetahui hasil dang lebih nyata. Pada pengamatan yang dilakukan selama ini, belum memperlihatkan hasil yang optimal bahkan belum menunjukkan adanya respon yang positif pada isolasi yang dilakukan dan ini terbukti dengan belum adanya perkembangan pada isolasi yang dilakukan.

Salah satu faktornya adalah penggunaan media isolasi yang kurang cocok. Media yang digunakan dalam praktikum isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan biakan in vitro daun anggrek adalah media KpR yang dimodifikasi oleh Kao et. al. (1975) menggunakan hara makro dengan meningkatkan unsur Cl dua kali lebih tinggi dan mengurangi unsur amonium nitratnya lebih dari 50% dibanding hara makro pada media MS Penambahan unsur CaCl2 dapat meningkatkan persentase pembelahan sel. Sebaliknya penambahan unsur amonium nitrat akan mengurangi frekuensi sel yang membelah. Selain modifikasi komposisi hara makro, komposisi vitamin pada media KpR jauh lebih tinggi dibanding komposisi vitamin pada media lain.

Zat pengatur tumbuh terutama auksin dan sitokinin selalu ditambahkan kedalam media inisiasi. Jenis auksin dan sitokinin serta konsentrasi dan perimbangan kedua jenis persenyawaan tergantung dari jenis tanaman. Auksin yang paling umum digunakan adalah 2,4-D. Tetapi pada beberapa jenis tanaman, seperti tembakau, NAA lebih baik dari pada 2,4-D. Sitokinin yang biasa dipergunakan adalah BAP, kinetin, dan 2-iP. Kebutuhan auksin dan sitokinin pada kultur protolasma kadang-kadang dapat diperkirakan berdasarkan kebutuhan kultur sel dan jaringan utuh. Tetapi tidak selalu benar, bahwa sifat dan kebutuhan protoplasma sama dengan sifat dan kebutuhan selnya. Scrowcroft et al. (1973) menemukan bahwa sifat sel tumor yang dapat tumbuh dan membelah tanpa auksin, hilang pada waktu dinding sel dihilangkan. Sifat auksin-otonomnya muncul lagi setelah dinding sel terbentuk dan telah membelah diri. Oleh karena itu, penambahan hormone tumbuh dan komposisi media merupakan salah satu factor yang sangat penting untuk menunjang keberhasilan isolasi dan kultur protoplasma.














IV PENUTUP
A. Kesimpulan
Dari kegiatan praktikum isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan biakan in vitro daun anggrek dapat disimpulkan bahwa isolasi dan kultur protoplasma pada tanaman tebu dan daun anggrek belum menunjukkan respon yang positif dan pengamatan masih membutuhkan waktu lanjutan untuk mengetahui hasil yang maksimal.

B. Saran
Kegiatan praktikum isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan biakan in vitro daun anggrek perlu dilakukan penanganan dan pengamatan lebih lanjut untuk mendapatkan hasil yang lebih baik dan respon yang lebih positif dan nyata dari kultur yang dilakukan.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar